香菇富含多種營養(yǎng)（包括維生素、蛋白質、脂肪酸、氨基酸、礦物質元素），同時具有宜人的香氣，食之味道鮮嫩，口感絕佳，食用價值較高。香菇又被稱為冬菇或香蕈，在分類學中屬于擔子菌綱，傘菌目，口蘑科，香菇屬，是一種為人們所喜愛的常見食用菌。中國是香菇消費和生產(chǎn)的大國，并且中國的香菇栽培規(guī)模也位列于世界的前端，然而在香菇的育種研究方面卻有些許落后。所以，當務之急是香菇新品種研發(fā)以及原有品種的改良工作。

目前較為常用的育種手段是原生質體技術，這一技術能夠在一定程度上有效縮短食用菌的育種周期，但是，此項技術還未在全國范圍內進行推廣實施，目前由原生質體技術所派生出的育種技術主要有以下4類，原生質體誘變、原生質體轉化、原生質體融合、原生質體單核化。相對于其他育種方式而言，原生質體育種具有育種周期短、效率高的特點，同時對于食用菌的品質、產(chǎn)量以及抗性都有顯著的提升效果，進而提高香菇的育種水平。這個過程里面原生質體育種的基礎是原生質體的制備和再生。所以，本文重點研究外部環(huán)境條件對于香菇原生質體產(chǎn)量與再生率的影響，以此作為食用菌類的原生質體育種工作的參照。

1　材料與方法

1.1　供試材料

供試食用菌種：香菇（Letinula Edodes）遼撫4號編號0912，由撫順市農(nóng)業(yè)科學研究院提供；母種培養(yǎng)基（克/升）：馬鈴薯200.0、蔗糖10.0、葡萄糖10.0、蛋白胨2.0、木屑150.0（煎汁過濾）、硫酸0.5、磷酸二氫鉀1.0、水1000.0、瓊脂粉12.0，培養(yǎng)基的酸堿度調整至5.5；再生培養(yǎng)基：與母種相同，外加穩(wěn)滲劑進行定容。

穩(wěn)滲劑配置：甘露醇、0.4摩爾/升的硫酸鎂、氯化鈉、氯化鉀，pH=5的蔗糖和葡萄糖液體。其他試驗試劑：0.22微米微孔濾膜過濾除菌，該試劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用，酶液用對應穩(wěn)滲劑配制酶濃度（W/V，重量體積比）1.0%的蝸牛酶，纖維素酶與混合酶（蝸牛酶∶纖維素酶=1∶1）。Cellulase（MP Biomedical）及Snailase（Wolsen）等為國產(chǎn)分析純。

1.2　試驗方法

原生質體數(shù)量統(tǒng)計：利用血球板進行計數(shù)，首先將原生質體稀釋至108，涂至平板上，然后按照公式：原生質體產(chǎn)量（個/毫升）=每格平均原生質體數(shù)×400×稀釋倍數(shù)×104進行計算。原生質體再生率（%）=[(再生平板菌落數(shù)-CK板菌落數(shù)）×稀釋倍數(shù)]/（涂布體積×原生質體濃度）×100方案設計：選取7個外部環(huán)境因素，考察這7個外部環(huán)境因素對香菇原生質體的產(chǎn)量以及再生率的具體影響。詳情見表1。

2 結果與分析

2.1　不同種類裂解酶原生

質體產(chǎn)量與再生率的影響如圖1所示，混合酶的酶解效果要比單一酶所產(chǎn)生的酶解效果好一些，混合酶作為酶解介質時，單位時間內原生質體的產(chǎn)量最高能達5.69×108個/毫升，此產(chǎn)量是蝸牛酶作為酶解介質原生質體產(chǎn)量的1.42倍，是纖維素酶作為酶解介質產(chǎn)量的4.15倍；混合酶作為酶解介質時，原生質體再生率是0.91%，蝸牛酶作為酶解介質的原生質體再生率為0.9%，達到了纖維素酶作為酶解介質時原生質體再生率的2.39倍。產(chǎn)生如此大差異的原因是，香菇自身的菌絲細胞壁組成成分比較復雜，因此，需要不同種類的酶共同作用，才能對其產(chǎn)生較好的降解作用。在此組試驗中，蝸牛酶是包含了淀粉酶、蛋白酶等20多種不同種類的酶于一體。因此，其酶解效果與混合酶一樣能夠較好的刺激原生質體的再生，但是纖維素酶成分比較單一，故而對原生質體的酶解效果一般。綜上研究，在后續(xù)的多因素試驗中會優(yōu)先選擇混合酶作為介質。

2.2　酶解時間對原生質體產(chǎn)量與再生率的影響

通過圖2可以看出，酶解時間在3小時之內時，原生質體再生率與時間呈正相關的關系，隨著時間的增加，原生質體的產(chǎn)量也不斷增加。之后，原生質體的再生率則會出現(xiàn)下降。在整個酶解過程中原生質體產(chǎn)量從2小時后明顯上升，2.5小時后逐漸下降?；貧w分后，可知酶解時間為2.82小時，原生質體再生率達到頂點1.7%；酶解時間為3.44小時，原生質體產(chǎn)量達到最高2.27×108個/毫升。

2.3　酶解溫度對原生質體產(chǎn)量與再生率的影響

原生質體的產(chǎn)量及再生率受溫度影響效果明顯，其中30℃是原生質體產(chǎn)量變化的臨界點，在這之前原生質體產(chǎn)量醉著溫度升高而增加，之后則出現(xiàn)明顯的下降。經(jīng)過回歸方程計算可以得出，原生質體再生率在30℃達到最高，為1.08%，原生質體產(chǎn)量在29℃達到最高，為4.06×108個/毫升。分析其他酶解介質可以得出，蝸牛酶的最適酶解溫度范圍是30～37℃，纖維酶的最適酶解溫度為35℃左右，當溫度處于最適酶解溫度時，其對于菌絲體細胞壁的酶解效果最好。因此，菌絲的細胞壁分解效率較高。而對于混合酶來說，雖然在35℃時酶活性較高，但是較高的溫度會擾亂菌絲的內部代謝，影響細胞體內部穩(wěn)定性，最終影響原生質體的產(chǎn)生。因此，當溫度高于30℃，原生質體的再生率和產(chǎn)量均出現(xiàn)了明顯下降。

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