（5）抗菌成分的胰蛋白酶水解作用試驗(yàn)

選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進(jìn)無菌檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液，每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無菌檢測(cè)牛津杯，將0.1mL濃度值為l×10⁸CFU／mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養(yǎng)基中，當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結(jié)，做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測(cè)量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時(shí)用鹽水做為對(duì)比。選擇抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種作事后科學(xué)研究抗菌試驗(yàn)中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種CFS，各自調(diào)整pn為胰蛋白酶K、胃蛋白酶和蛋白酶的適宜功效pH，按1.0mg／mL各自添加胰蛋白酶K(適宜pH7.0)、胃蛋白酶(適宜pH2.0)、蛋白酶(適宜pH7.0)，37℃下溫育1h，將CFS的pH調(diào)返回5.0，牛津杯法精確測(cè)量其抑菌圈直徑，反復(fù)3次，以沒經(jīng)胰蛋白酶解決過的pH=5.0的CFS為對(duì)比。認(rèn)證乳酸菌飲料CFS的抗菌活性物質(zhì)是不是為蛋白質(zhì)類。

（6）乳酸菌飲料組織學(xué)特點(diǎn)觀查

選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進(jìn)無菌檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液，每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無菌檢測(cè)牛津杯，將0.1mL濃度值為l×10⁸CFU／mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養(yǎng)基中，當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結(jié)，做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測(cè)量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時(shí)用鹽水做為對(duì)比?？咕囼?yàn)中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種注射于MRS固態(tài)平板電腦上四劃分線，37℃厭氧發(fā)酵塑造48h，觀查固態(tài)平板電腦上的菌體形狀特點(diǎn)并挑菌單菌體開展革蘭氏染色試驗(yàn)，鏡檢查觀查菌體上色結(jié)果和組織學(xué)特點(diǎn)。

（7）菌種鑒定

①生理學(xué)生物化學(xué)評(píng)定試驗(yàn)

參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》中的實(shí)驗(yàn)方法，選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進(jìn)無菌檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液，每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無菌檢測(cè)牛津杯，將0.1mL濃度值為l×10⁸CFU／mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養(yǎng)基中，當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結(jié)，做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測(cè)量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時(shí)用鹽水做為對(duì)比。抗菌試驗(yàn)中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種開展生理學(xué)生物化學(xué)評(píng)定。

②16SrRNA遺傳基因保守序列增加

選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進(jìn)無菌檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液，每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無菌檢測(cè)牛津杯，將0.1mL濃度值為l×10⁸CFU／mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養(yǎng)基中，當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結(jié)，做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測(cè)量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時(shí)用鹽水做為對(duì)比。

將抗菌試驗(yàn)中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種開展病菌基因的獲取，依照已買病菌DNA獲取檢測(cè)試劑盒使用說明試驗(yàn)操作流程開展。

③菌種鑒定并搭建系統(tǒng)軟件進(jìn)化樹

取5μL增加精彩片段100V工作電壓下，1％瓊脂糖電泳原理觀查結(jié)果(尺寸應(yīng)是1500bp上下)。認(rèn)證后的電泳條帶膠回收利用檢測(cè)試劑盒回收利用，回收利用物質(zhì)送上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。將菌種16SrRNA高通量測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查詢中已經(jīng)知道菌種保守序列開展核對(duì)，根據(jù)MEGAX手機(jī)軟件剖析目地基因序列的開放閱讀框，并搭建系統(tǒng)發(fā)育樹。

4、數(shù)據(jù)處理方法

每一個(gè)試驗(yàn)3個(gè)平行面，數(shù)據(jù)信息用x^–±s表明。

二、結(jié)果與剖析

1、乳酸菌飲料菌種分離出來

從安徽省當(dāng)?shù)厮岵酥袊?guó)共產(chǎn)黨分離出來得到10個(gè)溶鈣圈的乳白色單菌體，經(jīng)初始評(píng)定得到6株乳酸菌飲料，進(jìn)一步挑選提純后依照菌種來源于和挑菌次序取名。

2、抗菌試驗(yàn)結(jié)果

抗菌試驗(yàn)結(jié)果如圖所示1所顯示，菌種PC-3對(duì)2種指示菌抑菌圈直徑較大，抗菌實(shí)際效果最好是，對(duì)大腸埃希菌和金黃鏈球菌的抑菌圈直徑各自做到17.17 0.42mm和19.23±0.61mm。結(jié)果顯示該菌種對(duì)大腸埃希菌和金黃鏈球菌有極強(qiáng)的殺菌作用。緣故可能是乳酸菌飲料在成長(zhǎng)新陳代謝的環(huán)節(jié)中形成了有機(jī)物、H₂0₂或病菌素，進(jìn)而控制了標(biāo)示病菌的生長(zhǎng)發(fā)育。挑選PC-3號(hào)菌種做為事后試驗(yàn)菌種。

3、菌種PC-3生長(zhǎng)曲線圖和產(chǎn)酸曲線圖的測(cè)量

菌種PC-3生長(zhǎng)曲線圖和產(chǎn)酸曲線圖如圖2所顯示，該菌種在0～12h處在延滯期，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，延滯期相比較長(zhǎng)。菌種PC-3在12h后進(jìn)到對(duì)數(shù)期，菌體細(xì)胞快速繁衍生長(zhǎng)發(fā)育，在36h菌體細(xì)胞數(shù)做到最高值。在菌體進(jìn)到多數(shù)成長(zhǎng)期后菌液的pH快速減少，穩(wěn)定型時(shí)pH保持在4.0上下。
 

4、有機(jī)物和雙氧水清除抗菌試驗(yàn)結(jié)果

菌種PC-3CFS對(duì)二種指示菌的抑制效果，可能是菌種PC-3新陳代謝生成的病菌素或酸堿性尾端物質(zhì)如有機(jī)物或雙氧水功效的結(jié)果。如圖所示3所顯示，pH=5.0的菌種Pc-3CFS與初始CFS抗菌實(shí)際效果對(duì)比，對(duì)大腸埃希菌和金黃鏈球菌的抑菌圈直徑各自降低了7.0％和6.6％，表明pH=5.0的菌種Pc-3CFS與初始CFS抗菌實(shí)際效果相仿，事后實(shí)驗(yàn)中抗菌實(shí)際效果比較能夠 pH=5.0做為pH調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)；pH=5.0的乳酸菌和甲酸對(duì)照實(shí)驗(yàn)對(duì)二種指示菌的抑菌圈直徑顯著減少，抗菌實(shí)際效果非常明顯變?nèi)?，表明清除乳酸菌和甲酸的影響后，CFS中還出現(xiàn)別的抗菌化學(xué)物質(zhì)，菌種PC-3CFS中起關(guān)鍵殺菌作用的化學(xué)物質(zhì)并不是有機(jī)物類。