香菜為葉菜，其表層微生物菌種總數(shù)多，類型繁雜。微生物菌種的浸染不但會危害香菜的外型，本質(zhì)上也減少了服用使用價值，降低貨架期時間”。香菜栽種的土壤層、氣侯等自然環(huán)境情況不一樣，伴隨著栽培技術的提升與標準的擴張，現(xiàn)切生產(chǎn)加工經(jīng)營規(guī)模的不斷發(fā)展，從農(nóng)田到餐桌椅的階段增加，這種都提升了現(xiàn)切香菜微生物菌種環(huán)境污染的風險性，也增多了微生物菌種操縱的難度系數(shù)。

氫氧化鈣、氫氣、次氯酸鈣等能在水中造成次氯酸鈉的農(nóng)藥殺菌劑總稱之為有效氯農(nóng)藥殺菌劑，在其中次氯酸鈉是現(xiàn)階段使用最普遍的有效氯農(nóng)藥殺菌劑。此農(nóng)藥殺菌劑以氯為主導，在溶液中產(chǎn)生有強氧化性的次氯酸鈉，次氯酸鈉穿透微生物菌種的細胞質(zhì)進入體細胞，與胞內(nèi)蛋白質(zhì)造成鈦酸異丙酯反映進而凝結細胞液，可高效殺掉病菌，實際效果顯著且反應靈敏?，F(xiàn)階段，許多公司具體應用氫氧化鈣做為農(nóng)藥殺菌劑，并關鍵檢測菌落總數(shù)與大腸桿菌的調(diào)節(jié)狀況。因為氫氧化鈣很有可能存有氯殘余而對身體健康造成傷害嘲，因而必須 擴大翠綠色可靠的農(nóng)藥殺菌劑類型，持續(xù)發(fā)掘新的農(nóng)藥殺菌劑并嚴控其應用濃度值。

次氯酸鈉溶液是一種酸堿性氧化劑，可溶強電解質(zhì)、酒精、醫(yī)用乙醚、鹽酸等有機溶劑，有很強的刺激怪味，對人的雙眼、肌膚、粘膜和呼吸道有刺激效果，特性不穩(wěn)定，受熱或有機化合物、金屬離子、強酸等易溶解。

次氯酸鈉溶液可消滅細菌繁殖體、細菌、病毒感染、分枝桿菌、細菌芽孢等微生物菌種，且在較低溫度下仍合理，其滅菌實際效果受濃度值、溫度、空氣濕度、有機化合物等要素危害網(wǎng)。次氯酸鈉溶液在濃度值為50mg/1下就能實現(xiàn)較好的滅菌實際效果，基本上對全部現(xiàn)切蔬菜水果表層的腐壞菌和病原菌有顯著抑止實際效果，但因其穿透性不強，較低濃度的下雖對飄浮的微生物菌種實際效果顯著，而對牢牢地吸咐在現(xiàn)切商品表層的生物功效不顯著嘲。次氯酸鈉溶液反映的副產(chǎn)品是水和O2，對身體和自然環(huán)境無毒性沒害，因而被覺得是一種環(huán)保節(jié)能的農(nóng)藥殺菌劑，F(xiàn)DA已經(jīng)將其列入非清洗食品類觸碰表層消毒殺菌劑。次氯酸鈉溶液做為氯系農(nóng)藥殺菌劑的代替品，在現(xiàn)切蔬菜水果生產(chǎn)加工中獲得普遍科學研究與運用。

與含氯制劑對比，二氧化氯不容易與有機化合物反映轉化成致癌物質(zhì)、致基因突變、胎兒畸形的化學物質(zhì)，是現(xiàn)在世界上認可。的全新一代高效率、廣譜性、安全性的除菌防腐劑同。它能快速空氣氧化病毒蛋白質(zhì)衣殼中的色氨酸，抑止疫情的非特異吸咐，阻攔其對靶細胞的浸染，還能與病菌以及他微生物菌種蛋白中的一部分碳水化合物產(chǎn)生氧化還原反應反映，溶解毀壞碳水化合物，抑止微生物菌種蛋白質(zhì)合成，進而造成 微生物菌種身亡。很多歐洲國家相關機構已許可和強烈推薦二氧化氯用以食物的消毒殺菌、防腐蝕、冷藏等，世衛(wèi)組織(WH0)已將二氧化氯列入A1級安全性高效消毒劑，在我國衛(wèi)生計生委也已準許二氧化氯為消毒液和新式食用添加劑。

以上3種減菌劑在現(xiàn)切香菜中的減菌實際效果還欠缺科學研究，因而創(chuàng)作者選用氫氧化鈣、二氧化氯和次氯酸鈉溶液解決現(xiàn)切香菜，明確合適于現(xiàn)切蕪荽的最好減菌劑，根據(jù)16SrDNA全基因組測序技術檢查鑒定現(xiàn)切香菜表層細菌種類，剖析關鍵發(fā)病與致腐病菌，以求更合理地提升現(xiàn)切香菜商品的安全系數(shù)。

1 原材料與方式

1.1 實驗原材料

香菜：市面上。

1.2 關鍵實驗試劑及儀器設備

1.2.1 關鍵實驗試劑

氫氧化鈣、二氧化氯、次氯酸鈉溶液、氧化鈉、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖水、瓊脂粉、乳清蛋白、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、月桂酸硝酸鈉、煌綠乳清蛋白膽鹽骨頭湯培養(yǎng)液、氫氧化鈉溶液、硫酸、酒精、牛肉膏、蛋白胨、結晶紫、草酸銨、碘片、碘酸鉀、番紅、松柏樹油、SK1201-UN10-10立柱式病菌基因DNA抽提檢測試劑盒等。

1.2.2 關鍵儀器設備

DJ300高精密電子分析天平：北京市賽多利斯儀器設備系統(tǒng)軟件有限責任公司商品；YXQ-SG41-280手提工作壓力蒸汽滅菌鍋：上海市華線醫(yī)療反物質(zhì)儀器設備有限責任公司商品：SW-CJ-1FD凈化工作臺：蘇凈集團蘇州市萬通氣體技術性有限責任公司商品；GRP-9160型防水防火式恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗室儀器有限責任公司商品；XW-80A小型漩渦混和儀：上海市滬西剖析儀器廠有限責任公司商品：HH-6數(shù)顯式恒溫水浴鍋：常州市國華家用電器有限責任公司商品：SPX-320型智能化生化培養(yǎng)箱：寧波市江南地區(qū)儀器廠商品；PCR反映增加儀：澳大利亞BBI企業(yè)商品：3730轉錄組測序檢測儀：美罔ABI企業(yè)商品；H6-1小型電泳槽：上海市精益求精有機玻璃板產(chǎn)品儀器廠商品；凝膠成像系統(tǒng)軟件：GeneGenius企業(yè)商品。

1.3 實驗方式

1.3.1 試品及減菌劑的提前準備

選擇無枯黃、無機械設備傷、無病害、新鮮程度基本一致的當?shù)噩F(xiàn)切香菜，去根，冷水洗至可立即服用，晾曬至無水跡，備用。

氫氧化鈣(5.2mg/1)配置成濃度值為0、50、100、150、200、250mg/1的水溶液，測量pH各自為6.32、10.33、11.37、11.70、11.90、12.07。

二氧化氯(8mg/1)配置成濃度值為0、20、40、60、80、100mg/1的水溶液，測量pH各自為5.90、3.16、2.87、2.73、2.56、2.41。

次氯酸鈉溶液(15.7mg/1)，由A液(醋酸和鹽酸)和B液(雙氧水)以容積比10:8制取1000mg/1水溶液，反映24h后稀釋液成0、50、100、150、200、250mg/1，測量PH各自為6.93、4.79、4.03、3.78、3.60、3.52。
1.3.23種減菌劑解決

較為3種減菌劑減菌實際效果，挑選實際效果最好的減菌劑，以提升減菌劑解決主要參數(shù)。3種減菌劑解決標準見表1。全部解決在常溫下開展，每一個解決反復3次。

1.3.3 二氧化氯正交和解決

依照1₉(3⁴)正交表，對解決濃度值(20、40、60mg/1)、解決時間(2、5、10min)、水菜容積質(zhì)量比(4m1:1g、8m1:1g、12m1:1g)三要素開展正交實驗，對照實驗為冷水洗前及冷水洗后備用的試品。正交試驗表見表2。

1.4 測量指標值與方式

1.4.1 菌落總數(shù)

參考GB/T4789.2-2016。

1.4.2 大腸桿菌

參考GB/T4789.3-2016。

1.5 病菌的分離純化與儲藏

無菌檢測自然環(huán)境下，稱量25g現(xiàn)切香菜置盛有225m1無菌檢測鹽水的錐形瓶中，放置搖床80r/min，搖晃20min，馬上將試品液稀釋液至1×10^-3、1×10^-1、1×10^-5二三個梯度方向，汲取1m1試品勻液于無菌檢測培養(yǎng)皿內(nèi)，每一個稀釋液度做兩個反復與此同時，各自汲取1m1無菌檢測鹽水添加兩個無菌檢測培養(yǎng)皿內(nèi)作空白試驗。立即將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液竭盡培養(yǎng)皿，并旋轉培養(yǎng)皿使其混和勻稱。于(36±1)℃顛倒控溫塑造(48±2)h。實驗反復3次、觀查病菌的成長狀況及菌體的顏色和特點，并選擇優(yōu)點菌挑菌單菌體，選用平板劃線法于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液畫線提純。于(36±1)℃顛倒控溫塑造(48±2)h。持續(xù)提純5代。

挑菌提純第5代的單菌體注射于牛肉膏蛋白胨斜坡，于(36±1)℃顛倒控溫塑造(24±2)h。放置4℃冰柜中儲藏。

1.6 病菌形狀觀查

1.6.1 簡落形狀觀祭

觀查提純第5代平皿內(nèi)菌體尺寸、菌體形狀、菌體色調(diào)、菌體表層特點(光潔是否、干躁是否、是不是突起、是不是全透明、是不是存有同舟環(huán)等)、邊沿標準是否。

1.6.2 革蘭氏染色

參考CB/T4789.28-2013。

1.7 16SrDNA序列的剖析以及系統(tǒng)發(fā)育樹的創(chuàng)建

1.7.1 DNA獲取

參考上海生工SK1201-UNIQ-10立柱式病菌基兇組DNA抽提檢測試劑盒使用說明書實際操作。

1.7.2 PCR擴增病菌的16SrDNA序列

1) 引物設計編碼序列

正方向引物設計27F：5’-AGACTTTCATCCTGGCTCAG-37；反方向引物設計1492R(1510)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

2) PCR反映管理體系創(chuàng)建(50μ1)

模版DNA10pmo1，上游引物1μ1，中下游引物設計1μ1，dNTPMix1μ1，10×TaqreactionBuffer5μ1，高保真音響聚合酶(5U/μ1)0.25μ1，無菌檢測超純水系統(tǒng)補充至50μ1。

3) PCR程序流程設置

98℃預轉性5min：95℃轉性35s，55℃淬火35s，72℃拓寬90s，3五個循環(huán)系統(tǒng)；拓寬8min。

1.8 屬種評定

將PCR物質(zhì)送至轉錄組測序企業(yè)開展轉錄組測序。將轉錄組測序進行的16SrDNA序列在GenBank(NCBI)中開展B1AST查找，找尋類似編碼序列并免費下載，用MEGA制作軟件系統(tǒng)發(fā)育樹明確病菌屬種。

1.9 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)信息取3次反復均值，選用Exce1、SPSS18.0、正交設計小助手等手機軟件對信息開展剖析。