2.3 UPLC-DAD-BChE線上統(tǒng)計分析方法

2.3.1 UPLC色譜儀標(biāo)準

離子交換柱Xtimate UPLC C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；流動速度：0.08 mL·min-1；流動性相:工業(yè)甲醇(B)-0. 1%苯甲酸溶液(A)。

吳茱萸色譜儀標(biāo)準：檢驗光波長330 nm；梯度方向過柱:0～5 min，10%B；5～50 min，10%～45%B；50～70 min，45%～95%B；70～85 min，95%B。

鉤藤色譜儀標(biāo)準：檢驗光波長 245 nm；梯度方向過柱:0～10 min，10%～30%B；30～70 min，30%～45%B；70～90 min，45%～95%B；90～100 min，95%B。

玄參和山豆根（苗）色譜儀標(biāo)準：檢驗光波長225 nm；梯度方向過柱:0～5 min，5%B；10～40 min，5%～50%B；40～80 min，50%～95%B；80～90 min，95%B。

蓮芯堿色譜儀標(biāo)準：檢驗光波長：290 nm；流動性相：工業(yè)甲醇（B）-0.1%苯甲酸水溶液（A）（20:80）。

UPLC流動速度：0.08 mL·min-1；柱后BChE、DTNB混和水溶液和BTCI流動速度各自為0.30 mL·min-1和0.10 mL·min-1。

2.3.2 UPLC-DAD-BCD線上聯(lián)用儀器設(shè)備系統(tǒng)軟件

UPLC-DAD-BCD聯(lián)用儀器設(shè)備設(shè)備見圖1。水溶液流路選用三通管和同樣直徑的PEEK管聯(lián)接。柱后衍化儀泵一為酶和DTNB混和水溶液，泵二BTCI水溶液。提取液歷經(jīng)UPLC離子交換柱分離出來后，在PDA探測器表明指紋圖譜，再與柱后衍化儀中的水溶液反映，經(jīng) DAD探測器檢驗獲得活力圖普，酶 DTNB、BTCI水溶液流動速度各自為0.30和0.10 mL·min-1，反映管0.5 mL，在405 nm檢驗酶抑止活力圖普。其反映基本原理如下所示：當(dāng)柱后衍化儀以穩(wěn)定的流動速度運送BChE與DTNB混和水溶液和BTCI水溶液，3種水溶液在反映管內(nèi)持續(xù)反映，轉(zhuǎn)化成的5-thio-2-nitrobenzoate為淡黃色物質(zhì)，可在405 nm處檢驗獲得穩(wěn)定基準線。當(dāng)UPLC分離出來出活性物質(zhì)進到BChE反映管理體系，淡黃色物質(zhì)量減少，與此同時在DAD探測器上邊便會展現(xiàn)倒峰，進而完成BChE緩聚劑的在線監(jiān)測。

2.4 UHPLC-LTQ/Orbitrap MS方式

UHPLC剖析標(biāo)準同“2.4.1”，流動速度為0.2 mL·min-1。

質(zhì)譜分析標(biāo)準：電噴霧器正離子源（ESI）共價鍵方式；鞘氣（N2）和輔助氣（Ar）流動速度各自為40和10 arb. unit；毛細血管溫度320 ℃；離子源工作電壓3.5 kV，電流量100 μA；一級質(zhì)譜分析品質(zhì)掃描儀區(qū)域為100～1 000 m/z，屏幕分辨率為60 000；二級質(zhì)譜分析選用HCD方式，依靠一級質(zhì)譜分析掃描儀中的1th到5th強峰，屏幕分辨率15 000；HCD裂化動能35 V。

3 結(jié)果與探討

3.1 UPLC-DAD-BChE線上統(tǒng)計分析方法的調(diào)查

流動性看中的工業(yè)甲醇和乙腈能減少酶的活性，選用HPLC創(chuàng)建在線監(jiān)測方式需根據(jù)柱后分離減少流動性相在酶反映機制的占比，降低對酶促反應(yīng)的危害，此線上聯(lián)用方法會造成儀器設(shè)備的兼容模式等難題，造成 在線監(jiān)測方式可靠性較弱。本探討選用UPLC使流動速度為0.08 mL·min-1，不分離就可以達到在線監(jiān)測的規(guī)定。

蓮子芯被報導(dǎo)具備BChE抑制效果，依照“2.3.2”項下的方式 ，應(yīng)用UPLC-DAD-BCD對蓮芯堿抑止活力開展剖析，見圖2。圖2為五個不一樣濃度值蓮芯堿的UPLC圖普和BChE抑止峰(60，120，600，1 200和 1800 μg·mL-1)，以活力指紋圖譜的倒峰總面積為橫坐標(biāo)軸（X），蓮芯堿濃度值為縱軸（Y），獲得蓮芯堿的量效曲線方程Y= 351.56X3-1 098.8X2 1 473X-32.205 (R² = 0.999 7)，說明UPLC-DAD-BCD方式可以用以酶抑制劑的挑選和活力點評。由圖二上和下相匹配峰的保存期可獲得在線監(jiān)測的時間延遲為2 min上下。