肉食品中傷害最大的細(xì)菌是瘦臉針?biāo)鬆羁莶菅挎呔ǚQ肉毒梭菌，該菌在厭氧發(fā)酵環(huán)鏡中可造成肉毒毒素，肉毒毒素毒副作用比氰化鉀強(qiáng)一萬(wàn)倍。因?yàn)槿舛舅缶斐傻娜舛径舅氐挠卸径靖弊饔?，世界各地都容許肉毒梭菌緩聚劑一亞硝酸鈉做為食用添加劑在肉類食品中限定應(yīng)用。亞硝酸鈉在肉類食品中能夠顯著抑止瘦臉針?biāo)鬆羁莶菅挎呔斐蓛?nèi)毒素。可是近幾十年來(lái)，亞硝酸鈉已變成食品衛(wèi)生安全異議的聚焦點(diǎn)。由于在一定情況下（例如高溫），肉食品中殘存的亞硝酸鈉能夠 與分散碳水化合物和丙烯胺反映，轉(zhuǎn)化成痕量元素N-亞硝酸。小動(dòng)物及臨床流行病學(xué)科學(xué)研究結(jié)果顯示N-亞硝酸是強(qiáng)致癌物質(zhì)。

次磷酸鈉能夠 控制革蘭氏陽(yáng)性綠膿桿菌（包含肉毒梭菌），可以處理肉食品產(chǎn)品質(zhì)量難點(diǎn)，而且中國(guó)次磷酸鈉生產(chǎn)工藝及水準(zhǔn)持續(xù)提升 ，具有了生產(chǎn)制造食品級(jí)不銹鋼次磷酸鈉的工作能力，現(xiàn)階段早已到系統(tǒng)的、全方位的科學(xué)研究次磷酸鈉取代亞硝酸鈉的機(jī)會(huì)。次磷酸鈉是一種比較理想的工業(yè)級(jí)氧化劑，關(guān)鍵用以化學(xué)鍍鎳、電鍍工藝、有機(jī)化學(xué)工業(yè)生產(chǎn)、食品工業(yè)和冷藏、橡膠制品增稠劑。對(duì)于次磷酸鈉的殺菌作用，海外科研工作人員己經(jīng)開(kāi)始科學(xué)研究次磷酸鈉抑止肉毒梭菌的實(shí)際效果，嘗試做為亞硝酸鈉抗菌劑的替代品，獲得不錯(cuò)進(jìn)度。Rhodehamel等覺(jué)得次磷酸鈉口感上很柔和，無(wú)刺激性味，對(duì)肉類食品的顏色和抗氧化層面沒(méi)什么副作用，此外，次磷酸鈉是不確定性的一種好的抗菌劑，而且在1990年被審批為安全性化學(xué)物質(zhì)（GRAS）。Woodetal和PeggandShahidi試驗(yàn)說(shuō)明，次磷酸鈉添加到肉漿中，針對(duì)肉毒菌素的抑止是合理的。

本科學(xué)研究用不一樣含量的次磷酸鈉（下稱SHP）水溶液對(duì)肉食品中常用的六種有危害菌（生孢梭菌、脹氣莢膜梭、菌沙門菌、大腸埃希菌、橙黃色鏈球菌、蠟樣枯草芽孢菌）開(kāi)展抗菌解決，根據(jù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組抑菌圈尺寸比照，分辨SHP對(duì)六種菌的抗菌實(shí)際效果；并且以有抗菌實(shí)際效果的菌苗為研究對(duì)象，探尋SHP的最少抗菌濃度值；進(jìn)一步探索SHP抑止肉毒梭菌的最好抗菌標(biāo)準(zhǔn)。

依據(jù)《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》歸類標(biāo)準(zhǔn)，瘦臉針?biāo)鬆羁莶菅挎呔鷼w屬于試驗(yàn)室二級(jí)毒副作用菌，為高致病微生物，對(duì)科學(xué)研究工作人員的生命安全有一定威協(xié)，不宜試驗(yàn)室工作人員立即科學(xué)研究，因?yàn)樯咚缶奈ｋU(xiǎn)較小，而且其特性特點(diǎn)與肉毒梭菌極為類似，因此 許多專家教授用生孢梭菌替代肉毒梭菌開(kāi)展科學(xué)研究。因而，本畢業(yè)論文全部實(shí)驗(yàn)均以肉毒梭菌的科學(xué)研究取代菌生孢梭菌來(lái)進(jìn)行科學(xué)研究。

一、原材料與方式

1、原材料與實(shí)驗(yàn)試劑

次磷酸鈉（SHP）：純凈度≥99.8％，阿拉丁有限責(zé)任公司；生孢梭菌CICC（10385）干凍粉、脹氣莢膜梭菌CICC（22949）干凍粉、蠟樣枯草芽孢菌CMCC（B）63301干凍粉；

大腸埃希菌0157（EPEC）、沙門菌（阿貢納）、橙黃色鏈球菌ATCC（6538）、純凈水、液體石蠟、厭氧發(fā)酵帶；

加強(qiáng)梭菌培養(yǎng)液、PCA、LB骨頭湯培養(yǎng)液、加強(qiáng)梭菌瓊脂粉；

碳酸鈉AR。

2、儀器設(shè)備與機(jī)器設(shè)備

超凈工作臺(tái)、恒溫箱、電冰箱、厭氧罐、光度計(jì)。

3、實(shí)驗(yàn)方法

（1）SHP梯度方向液的配置

抗菌實(shí)際效果試驗(yàn)SHP水溶液配置：

取七個(gè)500mL容量瓶清洗殺菌，各自型號(hào)1～7。各自配置0mg/L、250mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L規(guī)范SHP水溶液，混勻。取7支整潔已殺菌試管嬰兒在無(wú)菌車間中每一個(gè)試管嬰兒各自放入不一樣含量的SHP水溶液10mL，型號(hào)，橡膠塞殺菌塞緊，預(yù)留，切勿將水溶液先裝進(jìn)試管嬰兒隨后變道殺菌。最少抗菌濃度值探尋SHP水溶液配置：

跟上面一樣解決方式各自配置0mg/L、2000mg/L、2200mg/L、2400mg/L、2600mg/L、2800mg/L、3000mg/L規(guī)范SHP水溶液。

（2）培養(yǎng)液的配置

加強(qiáng)梭菌培養(yǎng)液：稱量本產(chǎn)品38.0g，加溫拌和融解于1000mL純凈水中，散裝多個(gè)試管嬰兒中10mL，滴進(jìn)適當(dāng)液體石蠟封閉式液位，變道后121℃高壓滅菌15min，預(yù)留。

LB骨頭湯培養(yǎng)液、PCA、加強(qiáng)梭菌瓊脂粉：按表明稱量相對(duì)應(yīng)本產(chǎn)品，加溫拌和融解于1000mL純凈水中，散裝10個(gè)三角瓶中，121℃高壓滅菌15min，預(yù)留。

（3）菌種活化與菌液配置

生孢梭菌、脹氣莢膜梭菌：超凈工作臺(tái)中，用燒紅制冷的接種環(huán)將菌苗連接加強(qiáng)梭菌培養(yǎng)液試管嬰兒中活性24h；依照GB測(cè)菌落總數(shù)，將原菌液適度稀釋液操縱菌液濃度值大約在105上下。

沙門菌、大腸埃希菌、橙黃色鏈球菌、蠟樣枯草芽孢菌：超凈工作臺(tái)選用燒紅制冷的接種環(huán)將菌苗連接裝有10mLLB的三角瓶中活性24h；依照GB測(cè)菌落總數(shù)（大約在2.37×108），將原菌液適度稀釋液操縱菌液濃度值大約在106上下。

（4）抑菌圈的測(cè)量

生孢梭菌、脹氣莢膜梭菌抑菌圈的測(cè)量：

殺菌夾層玻璃培養(yǎng)皿底端區(qū)劃地區(qū)并序號(hào)1～7→倒平板每一個(gè)培養(yǎng)皿20mL→每一個(gè)平板電腦加100μL菌液施膠勻稱一每一個(gè)地區(qū)中間放上一個(gè)殺菌的牛津杯一每一個(gè)牛津杯里添加200μL相匹配序號(hào)的SHP水溶液一蓋好外蓋后放進(jìn)厭氧罐中并放進(jìn)厭氧發(fā)酵帶一封好厭氧罐外蓋移進(jìn)恒溫箱。做多個(gè)平行面試驗(yàn)，36℃下塑造24h，精確測(cè)量抑菌圈。

大腸埃希菌、沙門菌、橙黃色鏈球菌、蠟樣枯草芽孢菌抑菌圈的測(cè)量：殺菌夾層玻璃培養(yǎng)皿底端區(qū)劃地區(qū)序號(hào)1～7→移液器汲取1mL菌液各自進(jìn)入到培養(yǎng)皿中→加溫溶化PCA制冷至40～50℃倒平板→每一個(gè)地區(qū)中間放上一個(gè)殺菌的牛津杯→每一個(gè)牛津杯里用移液器添加200μL相匹配序號(hào)的SHP水溶液→蓋好外蓋移進(jìn)恒溫箱。做多個(gè)平行面試驗(yàn)，36℃下塑造24h，精確測(cè)量抑菌圈。

（5）SHP對(duì)肉毒梭菌、脹氣莢膜梭菌最少抗菌濃度值的測(cè)量

活性后原菌液混勻→散裝到7支試管嬰兒中每一個(gè)100μL一各自添加1～花了7天時(shí)間SHP水溶液lOmL→混勻滴進(jìn)適當(dāng)液體石蠟封閉式，36℃下塑造24h→取7支殺菌整潔比色皿→各自添加1～花了7天時(shí)間菌液（混勻）→600nm下測(cè)其OD值明確MIC。

（6）生孢梭菌的最好抑止標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量

SHP對(duì)身孢梭菌抑止關(guān)鍵受溫度、時(shí)間、pH要素的危害，挑選L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，方案設(shè)計(jì)如下所示。

取9個(gè)殺菌整潔夾層玻璃培養(yǎng)皿各自序號(hào)1～9→倒平板每一個(gè)培養(yǎng)皿20mL→用移液器每一個(gè)平板電腦加IOOμL菌液于培養(yǎng)液表層涂抹勻稱→每一個(gè)培養(yǎng)皿里放上三個(gè)殺菌的牛津杯→每一個(gè)牛津杯里添加相對(duì)應(yīng)pH的SHP水溶液200μL蓋好外蓋→放進(jìn)厭氧罐中開(kāi)啟厭氧發(fā)酵袋封住外蓋→同一塑造溫度的對(duì)照組移進(jìn)相匹配的恒溫箱→精確測(cè)量各對(duì)照組抑菌圈直徑尺寸，照相，紀(jì)錄，數(shù)據(jù)分析。對(duì)檢測(cè)結(jié)果開(kāi)展數(shù)據(jù)分析，找到最好組成，進(jìn)而明確SHP對(duì)身孢梭菌的最好抑止標(biāo)準(zhǔn)。

（7）數(shù)據(jù)信息數(shù)據(jù)分析

每一組試驗(yàn)反復(fù)3次測(cè)量，選用SPSSl9.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)信息完成數(shù)據(jù)分析及顯著性分析，數(shù)據(jù)信息選用標(biāo)準(zhǔn)偏差表明。

二、結(jié)果與探討

1、SHP對(duì)肉食品中的普遍有危害菌的抗菌實(shí)際效果

本分析挑選肉食品中常用的傷害菌，包含革蘭氏陽(yáng)性菌、脹氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、橙黃色鏈球菌、蠟樣枯草芽孢菌；革蘭氏陽(yáng)性菌陰性菌：沙門菌、腸子埃希氏菌，科學(xué)研究次磷酸鈉對(duì)每一種病菌是不是有控制實(shí)際效果。不一樣含量的SHP對(duì)肉食品中的六種有危害菌開(kāi)展解決，選用牛津杯法，見(jiàn)圖1，仔細(xì)觀察抑菌圈的形成狀況來(lái)判斷SHP對(duì)六種菌的抗菌實(shí)際效果，及其隨SHP濃度值轉(zhuǎn)變的抗菌發(fā)展趨勢(shì)。抑菌圈的尺寸展現(xiàn)了SHP抗菌實(shí)際效果的高低，抑菌圈越大表明SHP的抗菌作用越好。

圖1中，牛津杯的外直徑為8.0mm。下列實(shí)驗(yàn)中解決的試品要是沒(méi)有超過(guò)8.00mm的清楚的抑菌圈，視作沒(méi)有殺菌作用。